质粒提取ppt下载

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质粒的提取和纯化 内 容一.质粒的概念和提取原理二.碱裂解法的实验操作和原理三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理四.实验室使用的方法五.质粒纯化后的检测一.质粒的概念和提取原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活 . 一.质粒的概念和提取原理质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control) 一.质粒的概念和提取原理在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验中使用的三个溶液 1，溶液Ⅰ： 葡萄糖—使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部. Tris.Cl (pH8.0)—提供反应的最佳环境. EDTA (pH8.0) —Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，抑制DNase(脱氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生长. 实验中使用的三个溶液 2，溶液Ⅱ：NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释) 1％ SDS 注:要新从浓NaOH稀释制备NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性. NaOH细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化，瞬间就溶解. 当然SDS也是碱性的，但是很弱，只能抽提得到少量质粒 . 实验中使用的三个溶液 3，溶液Ⅲ： KAc 冰醋酸 ddH2O 注:冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH. KAc是提供K+和SDS反应，取代Na离子，形成十二烷基硫酸钾 (PDS)，而PDS是难溶于水的. SDS易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 ，同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不与DNA分子结合 . 二，碱裂解法的操作步骤 1，取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液，高速离心，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。 2， 加入溶液I，充分悬浮菌体细胞。 3，加入新配制的溶液II， 盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴5分钟。 4，加用冰预冷的溶液III， 摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。 5，4℃下离心15分钟。 二，碱裂解法的操作步骤 6，取上清液，加入 RNA酶A， 37℃水浴20分钟。 7，加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下高速离心10分钟。 8，取上层水相， 加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下高速离心10分钟。 9，取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇 ，室温放置几分钟 ，离心。 10，4℃下高速离心15分钟， 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下高速离心5分钟。 11，吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥 。 12，得到的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH2O进行溶解. 注意的事项一，在加溶液Ⅱ后:①.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；②.必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。二，加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净，否则对后面的实验有影响. 三，沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。 四，提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提 . 三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤 （1） 将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在 37 ℃剧烈震荡（ 250rpm ）培养过夜。 （2） 将 1.5ml 培养物转入离心管中，在 4 ℃条件下离心 30 秒。 （3） 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 缓冲液（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton， 50mmol/L EDTA，，10mmol/L Tris ） ，用涡旋混合器充分混匀。 （4） 加入 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下 5min 。 （5） 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时 45 秒，取出后立刻离心 10min 。 三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤（6） 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨) ，用混合器混匀后，高速离心 5min ，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。 （7） 加入 1.2M 氯化钠 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min ，弃上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 缓冲液中， 混合器混匀 。 （10） 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用. 四，实验室使用的操作步骤 1，取1.5ml含细菌的培养液，离心，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。 2，加入溶液I，充分悬浮菌体细胞。 3，加入新配制的溶液II， 盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴5分钟。 4，加用冰预冷的溶液III， 摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。 5，4℃下离心15分钟。四，实验室使用的操作步骤 6，取上清液加新的离心管中. 7，加入纯化树脂，混匀，放置10min. 8，将溶液转移到离心纯化柱中，高速离心. 9，倒掉下管中的溶液，再加80%异丙醇，洗涤两次，每次离心30s，再干甩一次，20min. 10，将离心纯化柱内管取出，放入新的离心管中，加入30μl的ddH2O 洗涤，静置10min，高速离心5min. 11.离心管中即得到溶于ddH2O的质粒. 五，质粒纯化后的检测eVX红软基地

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